基于SPR的中药小分子垂钓方法和技巧——海军军医大学副教授曹岩

　　分子垂钓是一种从复杂样品体系中寻找与已知生物分子相互作用的特定分子（如小分子、蛋白质、或其他生物活性分子）的实验技术，在生物学研究、中药研究、活性药物发现等领域中发挥重要的作用。

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　　分子垂钓是一种从复杂样品体系中寻找与已知生物分子相互作用的特定分子（如小分子、蛋白质、或其他生物活性分子）的实验技术，在生物学研究、中药研究、活性药物发现等领域中发挥重要的作用。表面等离子体共振（Surface plasmon resonance，SPR）技术是一种生物传感分析技术，可用于研究活性分子与靶点的相互作用，具有灵敏度高、特异性强、分辨率高、样品消耗少、实时监测等特点。在高通量药物筛选、候选药物亲和力测定、抗原表位鉴定等生物医药领域应用广泛。

　　近年来，基于SPR的分子垂钓技术越来越引起广大科研工作者的兴趣，该技术利用SPR的高灵敏度、高特异性等特点，以及SPR仪器的实时监测、自动化进样和回收流程，并结合高分辨质谱鉴定，不仅能用于从细胞裂解液中垂钓蛋白质等生物大分子，也能用于从中药提取液中垂钓小分子化合物。

　　本文以采用Biacore T200分子互作系统进行中药小分子垂钓为例，介绍SPR垂钓的方法和技巧。

　　基于SPR的中药小分子垂钓的基本原理是将一种已知生物分子（靶蛋白）偶联在传感芯片表面，再将包含潜在活性分子的复杂样品溶液（中药提取液）注入到传感芯片，进行SPR检测和活性分子回收。

　　在进样过程中，复杂样品溶液中的活性分子会和偶联在传感芯片上的生物分子发生结合，这种结合可能是特异性或非特异性，致使芯片表面物质的质量发生变化（图1-1）。进样结束后，继续注入缓冲液使未结合或弱结合的成分离开芯片表面，而强结合的成分留在芯片表面。接下来，为了避免管路中的复杂样品溶液混入后续回收的结合成分中，通过注入洗涤液清洗从样品到芯片表面之间的管路，去除管路中的复杂样品溶液（图1-2）。然后再注入洗脱液并孵育适当时间，使芯片表面上结合的小分子解离下来（图1-3）。最后将液体流向反转，使解离下来的样品原路返回并收集在样品溶解液中（图1-4）。由于一次仅可回收微量样品（2μL），可多次循环上述过程（一般10-20次），回收足够量的样品，合并后浓缩，用于后续质谱鉴定，最终发现复杂样品中的活性分子。图1  基于SPR的分子垂钓的基本流程

　　理解基于SPR的分子垂钓的原理是实验成功的第一步，在实际操作中还需要特别关注以下方面，这些将直接影响结果的准确性和可靠性。

　　1．靶蛋白的偶联量为了尽可能多回收活性成分，靶蛋白的高偶联量是至关重要的。一般首选CM5传感芯片通过-COOH与蛋白的-NH2发生反应，偶联效率较高，偶联水平可到达10000-20000 RU。对于不易提取纯化的跨膜蛋白，可选用L1 传感芯片，其表面可捕获囊泡和脂质体。另外还有SA传感芯片，其表面固定了链酶亲和素，可特异性偶联带有生物素标记的蛋白、多肽、核酸等。

　　2．靶蛋白的活性和特异性在垂钓实验前应验证偶联后靶蛋白的活性和特异性，这一验证实验可以通过对特异性抗体/抗原或已知的活性分子进行亲和力测定，以确认传感芯片上靶蛋白的结合活性，有助于提高垂钓结果的准确性和可靠性。

　　3．缓冲液的组成在复杂样品的“进样-回收”过程中，应注意维持适当的缓冲液条件，以提高回收效率。运行缓冲液和样品稀释液一般为PBS或EP；样品回收液一般为弱酸（三氟醋酸、甲酸、乙酸）、弱碱（NaOH）、表面活性剂（吐温20）、高盐溶液（NaCl）；样品溶解液一般为质谱兼容的挥发性盐溶液（NH4HCO3）。可采用已知的活性分子模拟筛选流程，以选择最佳的缓冲液条件。

　　4．实验的设计尽量减少假阳性结果，是高质量SPR垂钓实验的成功标志。为此，可通过对照实验和验证实验实现这一目标。对照实验：使用空白的CM5芯片重复垂钓过程，将回收到的样品作为阴性对照品进行质谱检测，在后续的数据分析中作为背景对照扣除。验证实验：鉴定出活性分子后，应获取其单体，采用SPR进行亲和力测定，以判断结合的特异性。如果同时鉴定出多个活性分子，也可以对他们的动力学或热力学参数进行比较分析，从而排除假阳性结果。

　　海军军医大学药学院 曹岩 副教授海军军医大学药学院，副教授，硕士生导师，上海市浦江人才。药物分析专业，博士学位，美国密歇根大学访问学者。以复杂药物和生物体系的分析技术为主要研究方向，从事基于表面等离子共振（